• Stato dell’arte
  La variabilità genetica del microbiota intestinale canino, esaminato in passato con metodi coltura-dipendenti, non è mai stata tenuta molto in considerazione, così come la pressione esercitata dalla selezione artificiale all’interno delle varie specie.

• Cosa aggiunge questa ricerca
  Un approccio NGS, nuovo e coltura-indipendente, basato sul sequenziamento dell’RNA ribosomale 16S e della regione ipervariabile ITS (Internal Transcribed Spacer) del Bifidobacterium, integrato poi ai risultati di un successivo sequenziamento metagenomico, è stato utile per ricostruire il microbiota intestinale di un ampio numero di cani sani, e per confrontare il “core” del microbiota intestinale canino con quello del lupo e dell’uomo.

• Conclusioni
  Questo studio supporta fortemente l’evidenza di una dettagliata co-evoluzione tra il cane e il suo microbiota intestinale, e della sua resilienza verso la selezione artificiale. Quest’ultima, in combinazione con l’addomesticamento, non solo influenza il genoma canino, ma plasma anche la popolazione batterica ospitata nell’intestino dei cani. Inoltre, si evidenzia l’importanza della dieta nella definizione del microbiota intestinale canino, come anche l’influenza dell’età.

Il tratto gastrointestinale dei cani è una complessa comunità di microrganismi che gioca un ruolo importante sia nel mantenere sia nel promuovere la salute dell’ospite. Uno studio pubblicato su Environmental Microbiology ha dimostrato che il core del microbiota intestinale canino è composto principalmente da Bacteroides, Fusobacteria, Firmicutes, Proteobacteria e Actinobacteria. Il microrganismo più rappresentato è il Fusobacterium.

Il cane domestico (Canis lupus familiaris) è l’animale da compagnia per antonomasia e sempre più attenzione è rivolta al suo benessere. I fattori che influenzano la salute intestinale canina, e quindi il relativo microbiota, sono diversi: la dieta, l’età, i disordini metabolici come l’obesità e il diabete e le patologie infiammatorie intestinali.

La recente introduzione di nuove diete, come per esempio la BARF (Bones and Raw Food), che promuove cibi crudi a scapito di vegetali e uova, ha modificato il regime alimentare canino. Questo comporta alcuni vantaggi, come il miglioramento della qualità del pelo e della pelle, la riduzione di patologie dentali e il lenimento delle artriti, ma anche alcuni svantaggi, come lo squilibrio nutrizionale e le infezioni batteriche.

Lo studio condotto da Giulia Alessandri e dai suoi colleghi dell’Università di Parma si è focalizzato sull’individuazione dell’evoluzione tassonomica e funzionale del microbiota intestinale canino e ha coinvolto 6 lupi selvaggi del Parco Nazionale degli Abbruzzi e 169 campioni fecali di cane, provenienti da 51 specie diverse. La selezione artificiale prima, e la coabitazione dei cani con i propri padroni poi, hanno influenzato la popolazione microbica dell’intestino canino, tanto che precise unità tassonomiche sono state acquisite o perse.

Inoltre, gli autori hanno eseguito un’analisi aggiuntiva avvalendosi di due ulteriori gruppi di cani: quelli alimentati secondo una dieta BARF, sostanzialmente a base di cibo crudo, e quelli alimentati con cibo commerciale CF (Commercial Food). Sia la composizione batterica sia il repertoire metabolico del microbiota intestinale canino risultano evoluti così da adattarsi alla qualità di cibo assunto (ricco in proteine oppure ricco in carboidrati).

Classificazione tassonomica della comunità microbica intestinale del cane lupo

Il DNA estratto da 175 campioni di feci provenienti da lupi e da 51 diverse specie canine, è stato sequenziato. Dall’analisi della diversità alfa si evince che i campioni coprono un giusto grado di biodiversità tra di loro, e dall’analisi della PCoA non si evince alcuna differenza significativa su base evolutiva tra i profili ottenuti (cani vs lupi). Inoltre, dall’analisi bioinformatica non si evidenzia alcuna differenza significativa tra i diversi microbioti canini analizzati in dipendenza della specie.

Il core del microbiota intestinale del Canis lupus familiaris analizzato al genus-level

Il core di un microbiota consiste nelle unità tassonomiche batteriche condivise dagli stessi campioni all’interno di una stessa coorte. La ricostruzione di questo core permette di identificare le specie batteriche prevalenti della comunità intestinale e del suo ospite conservate nel corso evolutivo. In questo studio sono state tenute in considerazione famiglie di batteri presenti almeno nell’80% dei campioni e con un’abbondanza relativa media almeno >0,01%. Sono stati così identificati 43 generi batterici. Scendendo però ancora più nello specifico, è emerso che il Fusobacterium è il microrganismo maggiormente presente in tutte le specie di cani domestici, suggerendo quindi una co-evoluzione tra questa unità tassonomica e il microbiota gastrointestinale del cane. Seguono, poi, Prevotella 9 e Bacteroides. Questi ultimi due, sorprendentemente, si ritrovano anche nel microbiota di uomini vegetariani o vegani, suggerendo quindi che la loro presenza sia in qualche modo legata alla transizione da dieta tipicamente carnivora (come quella dei lupi) a quella onnivora (dei moderni cani domestici).

L’influenza della dieta nella modulazione del core del microbiota intestinale canino

Allo scopo di capire se la dieta può influenzare la composizione del microbiota canino, sono stati analizzati due diversi gruppi di cani: il primo alimentato con dieta BARF e il secondo alimentato con CF. Dal loro confronto è emerso che il microbiota del gruppo CF presenta un più alto livello di complessità rispetto al gruppo BARF. Queste differenze sono state confermate anche dall’analisi della diversità beta. Fusobacteria e Actinobacteria aumentano significativamente nel microbiota di cani alimentati con dieta BARF, mentre i Bacteroidetes mostrano un trend opposto. Stranamente, i due generi batterici più rappresentati nel core, Fusobacterium e Bacteroides, non variano significativamente nei due gruppi analizzati. Al contrario, Prevotella 9, Faecalibacterium e Sutterella diminuiscono significativamente nel gruppo BARF se confrontato al gruppo CF. Alti livelli di Prevotella nel microbiota intestinale umano sono spesso associati a una dieta a base di fibre, dal momento che questo microrganismo è in grado di degradare i carboidrati semplici. Infine, una dieta a base di sola carne sembra favorire lo sviluppo di infiammazioni nell’intestino dei cani. Questo evento si riconduce alla ridotta presenza nel gruppo BARF del Faecalibacterium, un microrganismo con note caratteristiche anti-infiammatorie, capace di influenzare positivamente la fisiologia dell’intestino, come succede anche nell’uomo.

L’influenza della selezione artificiale e dello stretto contatto uomo-cane sul microbiota intestinale canino

Il cane è stato la prima specie animale a essere addomesticata a partire dai lupi selvaggi più di 15.000 anni fa, diventando poi l’animale da compagnia più desiderato dall’uomo. La forte pressione selettiva esercitata dall’uomo sulle specie canine ha prodotto diversi cambiamenti fenotipici e genotipici nei cani. Per comprendere se la selezione artificiale e lo stretto contatto con l’uomo abbiano influenzato il microbiota intestinale canino, sono stati confrontati i microbioti di cani con quelli di lupi cresciuti in condizioni selvagge. Anche in caso questo sono stati considerati generi batterici con una prevalenza >80%.

Sorprendentemente Bacteroides, Faecalibacterium, Anaerostipes, Fusobacterium e Ruminococcus gnavus sono generi condivisi da tutti i campioni analizzati, sia di cane che di lupo. Inoltre, è emerso che 23 unità tassonomiche batteriche ritrovate sia nei lupi che nei cani si sono co-evolute in entrambi gli animali a prescindere dall’intervento dell’uomo. Alistipes, Pseudomonas, Slackia, Subdoligranulum, Eubacterium coprostanoligenes e Barnesiella risultano assenti nel core del microbiota canino, suggerendo quindi che le modificazioni nello stile di vita e l’influenza dell’uomo (addomesticazione) abbiano favorito una regolazione del microbiota intestinale dei cani se paragonati ai loro antenati selvaggi.

Inoltre, i lupi sono sostanzialmente predatori, quindi la loro dieta è soprattutto a base di carne cruda. Se si confronta il microbiota intestinale del gruppo CF e del gruppo BARF con quello dei lupi emerge un aumento statisticamente significativo dell’abbondanza relativa di unità tassonomiche capaci di degradare i carboidrati come Prevotella 9 e Sutterella, spostandosi da una dieta tipicamente a base di carne cruda dei lupi e dei cani BARF a una dieta CF.

Valutazione della composizione del core della comunità intestinale canina vs quella umana

Al fine di spiegare se i cambiamenti del microbiota dei cani potessero dipendere dal loro addomesticamento e dalla co-abitazione con l’uomo, il core del microbiota intestinale canino è stato confrontato con quello umano. Da quest’analisi è emerso che gli unici due generi batterici canini non rappresentati nel core umano sono il Fusobacterium e il Ruminococcus gnavus, abitanti esclusivi quindi del microbiota canino. L’addomesticamento sembra aver fatto perdere ben 6 generi batterici, e 5 solamente sono condivisi tra uomo e cane. Dorea, Parabacteroides, Streptococcus sono invece microrganismi condivisi tra uomo e cane, ma non dal lupo. Quindi, il cambiamento da uno stile di vita naturale e selvaggio a uno in co-abitazione con l’uomo ha davvero provocato importanti cambiamenti nella composizione batterica dei cani domestici.

L’influenza dell’età sul core del microbiota intestinale canino

I cani oggetto di studio sono stati divisi in 4 diverse fasce di età: cuccioli, giovani, adulti e anziani. I campioni provenienti dai lupi sono stati esclusi da questa parte dell’analisi in quanto sarebbe stato impossibile sapere l’età di questi animali selvaggi. E’ emerso che Phascolarctobacterium, Roseburia e Fusobacterium differiscono parecchio tra i 4 diversi gruppi. Il Fusobacterium, per esempio, è più presente nei cani adulti, la Roseburia in quelli anziani, il Phascolarctobacterium maggiormente presente nei giovani. Si riscontra una significativa riduzione nella presenza del Bifidobacterium negli adulti e negli anziani, similmente a quanto succede negli umani.

Analisi del profilo della comunità bifidobacteriale, ospitata nel microbiota intestinale canino

Per condurre quest’analisi è stata utilizzato un sequenziamento gene-specifico rivolto alla regione iper-variabile ITS (Internal Transcribed Spacer) del Bifidobacterium. Dalla ricostruzione tassonomica si evince che il Bifidobacterium breve, il B. pseudolongum subsp. globosum, il B. longum subsp. longum, il B. pseudolongum adolescentis e il B. pseudolongum subsp. pseudolongum sono non solo i più abbondanti ma anche i più prevalenti nel microbiota intestinale canino. Invece, 7 altre specie di Bifidobacterium sono tra le più prevalenti ma non tra le più abbondanti, suggerendo quindi un loro adattamento nel colonizzare l’intestino canino. Inoltre, 4 di queste specie di Bifidobacterium sono molto rappresentate anche nell’intestino di tutti i mammiferi. Ad esempio B. breve, B. catenulatum e B. pseudocatenulatum colonizzano l’intestino dei cani e degli uomini, indicando quindi quanto l’influenza umana, come selezione artificiale, dieta e coabitazione abbiano favorito l’adattamento e la colonizzazione da parte di queste specie batteriche nel tratto gastrointestinale dei cani.

La dieta, fattore contribuente nel regolare la comunità microbica dell’intestino canino, ha un impatto anche sulla popolazione bifidobacteriale. Per esempio, la presenza del B. pseudolongum subsp. pseudolongum è molto diversa tra cani BARF e CF. Oppure, il B. animalis subsp. animalis e il B. choerinum, due microrganismi trovati tipicamente nell’intestino dei mammiferi, sono più rappresentati nel gruppo BARF rispetto al gruppo CF. Come ancora il B. catenulatum, B. magnum e il B.pseudocatenulatum sono meno rappresentati nel gruppo BARF rispetto al gruppo CF. Tutto questo conferma quindi la modulazione dieta-dipendente.

Caratterizzazione funzionale del microbioma fecale dei cani BARF e CF

Una successiva analisi metagenomica del microbioma ha presentato il quadro metabolico globale. L’analisi si è concentrata sull’enzima che idrolizza i carboidrati complessi, la glicosil idrolasi. E’ emerso che nei cani BARF i geni codificanti per la beta-galattosidasi, l’alfa-glucosidasi, l’alfa-mannosidasi e l’alfa galattosidasi sono più espressi rispetto ai cani CF. Invece, nei cani CF si registra una più alta espressione dei geni codificanti per gli enzimi coinvolti nella scomposizione dei polisaccaridi complessi derivanti dalle piante, come L-arabinofuranosidasi o xilanasi. Queste differenze sono giustificate dal diverso apporto di carboidrati e fibre di origine vegetale introdotte con la dieta, e quindi avvalorano ancora di più l’evidenza che la dieta influenza il glicobioma microbico intestinale.

Concludendo, questo studio ha dimostrato che il microbiota intestinale del cane domestico, per quanto abbia conservato alcune caratteristiche in comune con i suoi antenati selvaggi relativamente a composizione tassonomica e potenziale metabolico, è stato profondamente plasmato dalla selezione artificiale, da una nuova dieta e dallo stretto contatto con l’uomo.