• Cosa si conosce dell’argomento
  I vitelli nati e cresciuti nelle fattorie sono esposti ad agenti patogeni infettivi che mirano soprattutto alla mucosa dell’intestino tenue. La manipolazione del microbioma neonatale attraverso la dieta è stata proposta al fine di generare risposte a lungo termine negli ospiti. Attualmente, la conoscenza del microbioma intestinale nei primi mesi di vita nei vitelli neonati deriva dai soli profili di sequenziamento del RNA ribosomale 16S, e questo penalizza l’uso di strategie d’intervento a base di microrganismi.

• Cosa aggiunge questa ricerca
  Il sequenziamento metagenomico offre l’enorme vantaggio che le comunità microbiche sono studiate direttamente nel loro ambiente naturale, evitando problemi relativi ai prelevamenti e/o alla coltivazione in laboratorio. Integrando i risultati del sequenziamento metagenomico del tessuto che riveste l’intestino tenue con quelli del sequenziamento del rRNA 16S proveniente dai batteri della mucosa, è stata ottenuta una caratterizzazione completa della composizione tassonomica e funzionale del microbioma intestinale nei vitelli neonati.

• Conclusioni
  I risultati di questo studio hanno rivelato un’alta variazione animale individuale sia dal lato tassonomico che da quello funzionale, con un impatto piuttosto forte sulla risposta immunitaria del microbioma della mucosa intestinale nel periodo che precede lo svezzamento.

La mancanza di informazioni relative al microbioma intestinale nei vitelli neonati limita l’uso di strategie di intervento microbico, atte a migliorare la loro salute intestinale durante i primi mesi di vita. In uno studio pubblicato su Applied and Environmental Microbiology, il gruppo di Le Luo Guan ha ottenuto un profilo tassonomico e funzionale della composizione del microbioma che colonizza il rivestimento dell’intestino tenue nei vitelli neonati, eseguendo un sequenziamento “whole genome” metagenomico.

Il microbioma intestinale comprende milioni di geni non-ridondanti tutti necessari alla sopravvivenza microbica nel tratto gastrointestinale. La maggior parte di questi geni è di origine batterica. Gli autori di questo studio hanno cercato di chiarire il meccanismo attraverso il quale il microbioma può alterare la funzione immunitaria della mucosa (una vera e propria barriera) avvalendosi di un sequenziamento del metagenoma, ovvero dell’insieme delle informazioni genetiche di un’intera comunità microbica. Una vera novità per i ruminanti, per i quali la conoscenza del microbioma intestinale è molto limitata.

L’ottenimento del profilo del microbioma intestinale da vitelli neonati sani ha rivelato la composizione tassonomica e funzionale e le dinamiche associate all’insediamento del microbioma intestinale durante i primi mesi di vita. Questo è quindi il primo studio che presenta la composizione di tutti i gruppi microbici nell’intestino dei vitelli neonati.

Cambiamenti post-natali della composizione del microbiota

Il microbioma del rivestimento dell’intestino tenue in vitelli neonati è composto da batteri, archea, funghi, protozoi e virus a partire dalla prima settimana di vita. Il gruppo microbico dominante è quello dei batteri. In un campione di 15 vitelli Holstein bull è emerso che i phylum più numerosi sono i Firmicutes, Bacteroides, Proteobacteria e Actinobacteria, per il 93%. Nei microbiomi dell’intestino i generi ritrovati sono Clostridium e Eubacterium nel digiuno, Prevotella e Bacteroides nell’ileo. Quindi si può parlare di una presenza regione-specifica, molto influenzata anche dall’età del vitello: infatti, per esempio, il Lactobacillus è scarso in vitelli più grandi di una settimana nella sola regione digiunale e non nell’ileo. Questa differenza spaziale, però, viene persa se si confronta un gruppo interamente della stessa età piuttosto che tutti i gruppi di tutte le età insieme.

Il microbiota associato alla mucosa

Il DNA appartenente alla comunità batterica della mucosa dell’intestino tenue è stata sequenziato. L’abbondanza relativa di ciascun phylum cambia ampiamente a seconda dei singoli vitelli, ma i generi predominanti sono Propionibacterium, Prevotella, Lactobacillus nei vitelli di 1 settimana, Propionibacterium e Prevotella in quelli di 3 settimane, Bifidobacterium, Sharpea e Prevotella in quelli di 6 settimane. È da notare che Prevotella è stato ritrovato in almeno una regione intestinale di tutti i campioni analizzati. In ogni caso, confrontando la relativa abbondanza dei gruppi batterici mucosa-associati, non si osserva nessuna differenza significativa sia tra le diverse regioni che tra le diverse età.

Diversità e ricchezza del microbiota

L’età dei vitelli e le diete diverse fanno aumentare la diversità del microbiota del lume interno dell’intestino tenue, anche se questa differenza non diventa significativa se confrontata tra i diversi gruppi di età. La diversità e la ricchezza (intesa come numero di generi trovati) del microbiota dell’intestino tenue non risultano comunque diverse, sia in termini di regioni che di età, da quella del microbiota della mucosa.

Cambiamenti post-natali della funzionalità del microbioma

La funzionalità dell’intero microbioma è regolata da geni coinvolti principalmente in due grandi sistemi, che sono il metabolismo dei carboidrati e quello delle proteine. Invece, tra i sotto-sistemi dei microbiomi, l’unico sempre ritrovato è quello della “respirazione”, caratterizzato dall’attività di enzimi della fermentazione, come la deidrogenasi G3P anaerobica. Altri sotto-sistemi, ritrovati non in tutti i microbiomi, ma in almeno il 70%, sono “metabolismo dei carboidrati”, “metabolismo delle proteine”, “aminoacidi e derivati”, “fagi, profagi, trasposoni e plasmidi”, “metabolismo del DNA e dell’RNA”, “cofattori, vitamine, gruppi prostetici e pigmenti”. Confrontando diversi gruppi di età, così come diverse regioni dell’intestino, si riscontrano cambiamenti nell’abbondanza di determinati sotto-sistemi: per esempio, il metabolismo delle proteine è un sottosistema più abbondante in vitelli di 3-6 settimane che in quelli di 1 settimana, in due regioni del digiuno, ma non nell’ileo. Dal confronto dei risultati ottenuti dal sequenziamento metagenomico delle tre regioni dell’intestino tenue e dai tre gruppi di età, non si riscontrano cambiamenti temporali o spaziali. In ogni caso, i sottosistemi possono essere classificati in tre pattern in base ai trend di abbondanza relativa osservati temporalmente: “metabolismo delle proteine”, “metabolismo dei carboidrati” e “metabolismo di DNA/RNA”, i quali aumentano dalla prima alla terza settimana, ma poi rimangono stabili dalla terza alla sesta settimana.

Variazioni individuali nella composizione tassonomica e funzionale del microbioma

I coefficienti di errore all’interno di un singolo individuo sono stati confrontati con quelli del gruppo di età rilevante in modo da capire quale sia la variazione individuale del microbioma del tessuto dell’intestino tenue. Una più bassa variazione intra-individuale (ovvero quella tra le tre diverse regioni dell’intestino) rispetto a quella inter-individuale (ovvero tra i diversi gruppi di età) risulta evidente nei microbiomi di tutti i gruppi di età sia a livello tassonomico che a livello funzionale.

Utilizzando un approccio di clusterizzazione gerarchico sono emersi due diversi cluster dal punto di vista tassonomico: uno corrispondente ai microbiomi contenenti un’abbondanza relativa più alta di Lactobacillus, e un altro corrispondente ai microbiomi contenenti un’abbondanza relativa più alta di Bacteroides. Utilizzando lo stesso approccio, ma dal punto di vista funzionale, emergono altri due diversi cluster: il primo contiene vitelli dalle 3 alle 6 settimane, e il secondo contiene vitelli da 1 a 3 settimane. Il confronto di questi due ultimi cluster suggerisce che funzioni relative a “metabolismo delle proteine”, “aminoacidi e derivati”, “nucleosidi e nucleotidi” sono significativamente più arricchite nel cluster 1 rispetto al cluster 2 ( i relativi generi sono Bifidobacterium, Bacillus, Streptococcus, Lactococcus e Corynebacterium). D’altra parte, funzioni come “parete cellulare e capsula” e “metabolismo del solfuro” sono più arricchite nel cluster 2 rispetto al cluster 1 (i relativi generi sono quelli appartenenti ai batteri solfuro riducenti). Inoltre, dall’analisi funzionale si deduce anche un forte antagonismo tra Bifidobacterium e batteri solfuro-riduttori (SRB), suggerendo una relazione antagonistica, in quanto Bifidobacterium è capace di promuovere le funzioni di barriera dell’epitelio intestinale, mentre i SRB sembrano avere un impatto negativo sulla barriera epiteliale.

L’individuazione di questi specifici cluster fornisce una base da cui partire per l’analisi delle interazioni tra i microbiomi intestinali e la risposta immunitaria nei vitelli neonati.

Correlazione tra i cluster basati sulla tassonomia dei batteri identificati nell’ileo e il trascrittoma dell’ospite

Per capire se le variazioni osservate nel microbioma dell’ileo influenzassero a livello trascrittomico l’ospite, sono stati analizzati 3000 trascritti coinvolti nella risposta immunitaria della mucosa, ricavati dai risultati di un lavoro precedentemente pubblicato relativo al trascrittoma dell’ileo degli stessi vitelli. Tra i trascritti analizzati, 28 risultano up-regolati nei vitelli Lactobacillus – dominanti. Invece, 63 trascritti immuno-relati sono up-regolati nei vitelli Bacteroides- dominanti. L’analisi “Gene ontology” rivela che i trascritti up-regolati nei vitelli Lactobacillus – dominanti sono coinvolti in “chemiotassi leucocitaria e linfocitaria”, “pathway di segnale citochine/chemiochine” e “risposta infiammatoria”. Mentre i trascritti up-regolati nei vitelli Bacteroides- dominanti sono coinvolti in “adesione cellulare”, “risposta a stimolo”, “comunicazione cellulare” e “regolazione cascata MAPK”.

L’aumento della diversità e della ricchezza nelle comunità batteriche dell’intestino tenue (sia nel rivestimento che nel tessuto) con l’aumentare della età suggerisce un insediamento progressivo di un microbioma complesso durante le prime sei settimane di vita. La densità batterica totale sia del rivestimento dell’intestino tenue che dell’ambiente del lume intestinale nei vitelli neonati raggiunge livelli simili a quella dei vitelli svezzati dalla prima settimana. Dal confronto della composizione del microbioma dei vitelli di una settimana verso quelli di 3-6 settimane si riscontrano diversi cambiamenti forse dovuti alla dieta. Inoltre, la somiglianza tra i vitelli di 3 e 6 settimane supporta fortemente l’ipotesi di un insediamento di un microbioma introdotto dal cibo solido assunto. Un po’ come succede nell’uomo: infatti, il microbioma fecale inizia a stabilirsi e ad assomigliarsi tra diversi individui intorno ai tre anni di vita con l’assunzione di una dieta solida.

Uno dei maggiori problemi di salute nell’industria del bestiame è la diarrea nei vitelli neonati, spesso risolta mediante l’uso di antibiotici, tanto che molto spesso una profilassi a base antibiotica viene eseguita a priori nei vitelli durante il primo mese di vita per prevenire colonizzazioni intestinali patogeniche. Con l’aumentare delle restrizioni sull’utilizzo di profilassi antibiotiche, diventa quindi fondamentale cercare altre tecniche di manipolazione dei microbi che possano limitare o prevenire colonizzazioni da parte di agenti patogeni. Oggi i probiotici sono proposti come terapia in grado di ridurre la frequenza di colonizzazioni da E.coli nel tratto gastrointestinale dei vitelli, suggerendo quindi che promuovere l’insediamento di batteri “benigni” esclude l’insediamento di quelli patogeni.